4.3用于阿爾茨海默病生物標志物檢測


阿爾茨海默病的神經紊亂是進行性且不可逆的，會導致患者記憶喪失，且患者后期一般生活無法自理。β-淀粉樣蛋白是臨床早期診斷阿爾茨海默病的生物標志物。目前，已經有適配體生物傳感器用于Aβ蛋白檢測，基于這種電化學生物傳感器開發的檢測設備，具有靈敏度高、操作簡單、性能穩定、成本低、可小型化的優點，有較好的臨床應用前景。


ZHANG等發現，具有電活性的莖環適配體被固定在金電極上后，適配體上修飾的電活性物質二茂鐵（Fc）可通過識別淀粉樣蛋白寡聚體前后的構象變化導致的電荷轉移量的變化來檢測淀粉樣蛋白寡聚體，莖環（B-3'Fc）適配體與淀粉樣蛋白寡聚體結合后，Fc峰電流會降低；此外，通過優化交流伏安法的檢測頻率，可以進一步降低傳感器的檢測限，但同時會使檢測范圍變窄；基于這一發現，他們開發了一種基于莖環的電化學適配體傳感器，可高選擇性和高靈敏度地定量亞皮摩爾濃度的淀粉樣蛋白寡聚體，可能有利于阿爾茨海默病的診斷。


4.4病原微生物標志物檢測


微生物中的致病菌可以導致人類疾病，給人類健康和公共衛生帶來諸多挑戰。傳統的微生物檢測方法需要在培養基中培養病原菌，然后進行鑒定。用這種方法得到的結果雖然準確，但是至少需要4～7 d才能得到結果。其他方法，如酶聯免疫吸附試驗，依賴于抗原-抗體反應，易受pH值和溫度等環境因素的影響。電化學適配體生物傳感器病原體檢測技術具有操作簡單、成本低、靈敏度高、信號穩定、可小型化等諸多優勢，且可與微制造工藝兼容，并進行真實樣品檢測。


DAI等發現，具有反式切割活性的Cas12a核酸內切酶可對單鏈DNA啟動反式切割，將標記有亞甲基藍的單鏈DNA固定在金電極電化學傳感器，在待測物存在的條件下，Cas12acrRNA可啟動對非特異性單鏈DNA的反式切割，使亞甲藍的電流降低；基于這一發現，他們開發了一種基于CRISPR Cas12a（cpf1）的電化學生物傳感器——E-CRISPR，為了證明其系統通用性，他們將開發的E-CRIPSR首次應用于人乳頭瘤病毒和細小病毒B1916核酸檢測，結果顯示，由于優化了Cas12a體外反式切割的化學環境，無需任何酶促進擴增，E-CRISPR達到了皮摩爾水平的檢測限；他們進一步設計了基于E-CRISPR級聯的蛋白質靶點，用于檢測臨床樣本中的轉化生長因子-β1蛋白。相信在電化學和CRISPR的結合下，E-CRISPR可以成為便攜、精準和低成本的即時診斷系統的強大推動力。E-CRISPR的檢測原理見圖3。

圖3 E-CRISPR的檢測原理


5總結和展望


適配體傳感器在生物標志物的定量和定性檢測上有很多的應用。寡核苷酸適配體被認為是可識別生物標志物的智能分子。但是，盡管適配體已經被用于多種傳感平臺，仍有很多需要解決的問題和挑戰。


（1）大規模生產DNA/RNA適配體成本較高，且由于酶的存在，許多適配體在人血液中會被快速降解。有研究發現，添加具有生物相容性的官能團可提高其耐酶性；開發異種核酸作為有效和通用的適配體，在適配體的實際應用中也有較好的前景。


（2）靈敏度需要進一步提高。將適配體與量子點、金屬納米粒子等納米材料結合，采用DNA納米機器和滾動圓放大、聚合酶鏈反應等技術，可以提高適配體傳感器的靈敏度。ZHANG等提出了一種組裝方法——Bindinginduced DNA，可以檢測復雜樣本中低濃度的目標分子，這種檢測方法可以應用于脂類、核酸、低聚糖、病毒和病原體等多種生物分子的檢測。另外，信號放大也是在極低濃度被測物條件下提高檢測靈敏度的有效策略。


（3）適配體臨床檢測應用受限。雖然目前關于適配體傳感器的研究較多，但因信噪比較低、細胞基質和體液可能會掩蔽適配體、多通道檢測困難等不足，使適配體傳感器的臨床應用受到很大限制。傳感器的設計方面，可以將多個適配體固定在檢測平臺上，以同時檢測多種疾病標志物；另外，以納米技術為基礎的檢測平臺，有望實現高選擇性、高特異性、低成本、高效、快速、多通道檢測的目標。相信隨著研究的不斷深入，適配體傳感器會廣泛應用于臨床檢測。