石墨烯因其獨特的電學特性，是碳基生物傳感器（如微電極和場效應晶體管）的有前景的候選材料。最近，石墨烯生物傳感器已成功用于電生細胞的細胞外動作電位記錄；然而，由于缺乏有效的細胞穿孔方法，細胞內記錄仍超出其當前能力范圍。在此，我們展示了一種由垂直生長的三維模糊石墨烯（3DFG）構成的微電極平臺，能夠以高信噪比記錄細胞內的心臟動作電位。我們利用超快脈沖激光產生的熱載流子來穿孔細胞膜，并在3DFG電極與細胞內域之間建立緊密接觸。這種方法使我們能夠檢測藥物對人源心肌細胞動作電位形狀的影響。結合激光穿孔的3DFG電極可用于全碳細胞內微電極陣列，以監測細胞的電生理狀態。


一、介紹


監測神經元和心肌細胞的電活動對于研究大腦和心臟的電生理學、探究神經退行性疾病或心臟疾病以及開發新的治療策略具有根本的重要性。微電極陣列（MEA）平臺因其能夠通過同時測量數百/數千個細胞的電信號來監測大量細胞群而被廣泛使用。特別是在體外應用中，由于最近采用了新型二維（2D）和三維金屬電極配置，MEA方法在準確性與高通量之間提供了理想的平衡，這使得能夠記錄類似細胞內動作電位（AP）的信號。


石墨烯的非凡特性，如生物相容性、高電導率和柔韌性，使其成為開發用于研究可興奮細胞電生理學的微電極陣列和晶體管的絕佳候選材料。然而，迄今為止，基于石墨烯的設備僅限于細胞外場電位（FP）記錄，這無法像膜片鉗技術那樣捕捉到動作電位的主要特征。這極大地限制了石墨烯微電極在體外電生理學中的應用，因為準確監測細胞內動作電位的能力是毒理學研究和藥物篩選試驗的一項基本要求。


利用納米材料（如多孔鉑）在水中通過光能產生高能載流子（熱載流子）已被證明能夠以非常局部且非侵入性的方式穿孔細胞膜。在石墨烯基材料中，光照射已被證實能夠產生熱載流子。因此，激光刺激基于石墨烯的微電極陣列可能會導致局部細胞膜穿孔（光穿孔），從而實現細胞內記錄。此外，增加石墨烯基電極的可用表面積有望在激光照射時產生更高程度的熱載流子，從而降低穿孔細胞所需的激光強度。我們近期報道了一種高比表面積的石墨烯基納米結構：三維毛狀石墨烯（3DFG）。3DFG的形態使其成為實現可興奮細胞光穿孔以進行細胞內電活動記錄的理想候選材料。


在此，我們展示了利用3DFG多電極陣列（MEA）通過光穿孔進行心肌細胞動作電位（AP）的細胞內記錄。在近紅外（NIR）波段用超快脈沖激光照射時，3DFG電極中產生的熱載流子使細胞膜得以光穿孔。光穿孔與3DFG的高有效表面積相結合，能夠以高信噪比（SNR）記錄動作電位，從而能夠識別各種藥物對心肌細胞離子電流的影響。通過心肌細胞-3DFG電極界面的橫截面掃描電子顯微鏡（SEM）成像觀察到，石墨烯薄片的垂直形態進一步導致細胞質膜與3DFG電極緊密貼合。這項工作將推動開發出柔韌、低成本且生物相容的全碳MEA平臺，用于細胞內電活動記錄。此外，在近紅外二區（1000至1700納米）中石墨烯的低功函數可能使細胞穿孔在較厚的組織和類器官中的應用成為可能，因為它們在近紅外二區的吸收和散射較少。


二、結果與討論


01.掃描電子顯微鏡、光學和光電特性表征


通過等離子體增強化學氣相沉積（PECVD）按照先前報道的程序合成了3DFG。通過調整合成參數，例如合成時間，我們可以定制出平面外石墨烯薄片的尺寸和密度。按照標準的微納加工工藝制造了功能性3DFG微電極陣列（MEA）（圖S1；有關3DFG制造的詳細信息，請參閱材料與方法）。在MEA制造過程中，3DFG的平面外形態得以保留，從而形成了高表面積的微電極（圖1A和圖S2；有關3DFG MEA的結構和電化學特性的詳細信息，請參閱注釋S1和S2）。

圖1三維多孔金柵（3DFG）的掃描電子顯微鏡（SEM）成像和光學特性表征。（A）5微米3DFG電極的SEM圖像。比例尺：5微米（I）、1微米（II）和0.5微米（III）。（B）熔融石英（灰色）、在800°C下合成10分鐘的3DFG（紅色）和在800°C下合成30分鐘的3DFG（藍色）的紫外-可見光吸收率隨波長的變化。（C）3DFG在可見光和近紅外范圍內的介電常數的實部（ε1）和虛部（ε2）。（D）在1064納米超快（皮秒）脈沖激光激發下，3DFG電極與磷酸鹽緩沖液（PBS）界面產生的光電流，激光強度變化時的情況。脈沖序列持續時間為6毫秒。（E）激光激發產生的光電流的電容分量和法拉第分量。電容值取激光激發開始時的最大電流峰值。法拉第值計算為激光脈沖序列結束前最后1毫秒部分的平均值。


增加垂直于平面的石墨烯薄片的尺寸和密度會導致紫外-可見光（UV-Vis）吸收率上升，這從獲取的UV-Vis光譜（圖1B）中可以看出。增強的吸收可歸因于垂直于平面的石墨烯薄片對光的捕獲能力增強，因為這種結構類似于納米紋理硅和碳超材料。為了研究3DFG的光學響應類型，我們對在800°C下合成90分鐘的3DFG薄膜進行了表征，薄膜沉積在熔融石英基板上，通過橢圓偏振光譜法提取了材料在可見光和近紅外范圍內的介電常數（介電常數）的實部和虛部（圖1C）。介電常數提供了入射光子與材料相互作用類型的信息。特別是，如果材料具有負實介電常數，并且與具有正實介電常數的材料（例如空氣或水）相接，入射光子可以通過激發表面等離子體激元與之強烈相互作用。我們對3DFG介電常數的測量表明，在300至1700納米范圍內，3DFG并未表現出等離子體行為，其介電常數（ε1）為正值，如圖1C所示。